1. Trasnascadh agus Leithlisiú Millíní Cille
Le gach mias ina bhfuil meán saothraithe cille, cuir go leor formaildéad 16% chun tiúchan deiridh de 1% formaildéad a fháil.
Croith go réidh a mheascadh. Goir ag teocht an tseomra ar feadh 10 nóiméad i gcochall múch ceimiceach.
Le gach mias ina bhfuil meán saothraithe cille agus formaildéad, cuir tuaslagán glicín (10X) le tiúchan deiridh 1X. Croith go réidh a mheascadh. Goir ag teocht an tseomra i gcochall múch ceimiceach ar feadh 5 nóiméad.
Asúigh an meán ina bhfuil formaildéad/glicín sa chochall múch. Déan dramhaíl ina bhfuil formaildéad a dhiúscairt i gceart.
Nigh cealla faoi dhó le toirt amháin cultúir de PBS réamhfhuaraithe, ag baint de gach uair trí asú.
Cuir 1 ml de PBS réamhfhuaraithe leis na cealla agus dícheangail na cealla trí scríobadh. Aistrigh fionraí na cille go feadán micrealártheifneoir 1.5 mL ag baint úsáide as pípéad. Lártheifneoir ag 3000 × g ar feadh 5 nóiméad.
Bain PBS. Stóráil an millíní cille ag -80 céim nó téigh ar aghaidh go díreach chuig an rannán seo a leanas: Lysis agus díleá MNase.
2. Lysis agus díleá MNase
Bain úsáid as na cealla tras-nasctha a ullmhaíodh thuas. Má tá siad reoite, is féidir cealla a leá ar oighear.
Cuir 200 μL de mhaolán eastósctha membrane ina bhfuil coscairí próitéáis/fosfatase leis an millíní cille agus leis an bpípéad suas agus síos chun an millíní a dhí-chomhbhailiú. Vortex an feadán ar feadh 15 soicind agus gor ar an oighear ar feadh 10 nóiméad.
Lártheifneoir ag 9000 × g ar feadh 3 nóiméad agus bain an comhraiceoir.
Cuir na núicléis ar fionraí i 200 μL de thuaslagán oibre maolán díleá MNase.
Cuir 0.5 μL de MNase caolaithe (grád sliseanna) (10 U/μL) le 4.5 μL de mhaolán díleá MNase. Pípéad suas agus síos a mheascadh go maith
Cuir 2 μL de MNase caolaithe leis, vortex an feadán, agus gor i ndabhach uisce 37 céim ar feadh 15 nóiméad, ag inbhéartú gach 5 nóiméad.
Cuir 20 μL de thuaslagán stad MNase leis chun an t-imoibriú a stopadh, déan an vortex go hachomair, agus gor ar oighear ar feadh 5 nóiméad.
Lártheifneoir ag 9000 × g ar feadh 5 nóiméad chun na núicléis a fháil. Bain an súdaire.
núicléis a athshochtadh i 100 μL de mhaolán caolaithe IP 1X ina bhfuil coscairí próitéáis/fosfatase.
Cuir isteach ar an scannán núicléach ag sonicating le cúpla bíoga ar an oighear. Nóta: Is féidir na coinníollacha is fearr le haghaidh lysis iomlán a thabhairt faoi deara faoi mhicreascóp solais.
Lártheifneoir ag 9000 × g ar feadh 5 nóiméad agus aistrigh an súthach ina bhfuil crómatin díleáite go feadán nua 1.5 mL. Lean ar aghaidh le deascadh imdhíon nó stóráil samplaí ag -80 céim .
III. Imdhíon-fhrasadh
1. Aistrigh 10 μL den shástán ina bhfuil an crómatán díleáite go feadán 1.5 mL agus stóráil ag -20 céim . Seo 10% den sampla ionchuir iomlán ó shampla amháin.
2. Aistrigh an 90 μL atá fágtha de shárnáthach go 410 μL de mhaolán caolaithe 1X IP
3. Cuir antashubstaint phríomhúil leis
4. Measc agus gor an t-imoibriú IP ag 4 céim ar feadh 2 uair go dtí thar oíche. Nóta: Maidir le próitéiní íseal-raidhse, méadóidh gor thar oíche an comhartha go mór.
5. Rothlaigh an fheadán coirníní maighnéadacha de ghrád A/G próitéine ChIP chun fionraí aonfhoirmeach a fháil. Cuir 20 μL de choirníní maighnéadacha le gach IP agus measc agus gor ag 4 céim ar feadh 2 uair an chloig.
6. Tar éis goir, bailigh na coirníní le seastán maighnéadach agus bain agus caith amach go cúramach an súthach.
7. Cuir maolán níocháin 1 ml IP 1 leis, vortex go hachomair, measc agus gor ar feadh 5 nóiméad.
8. Bailigh na coirníní le seastán maighnéadach agus bain go cúramach agus caith amach an súthach.
9. Déan céimeanna 7 agus 8 trí huaire ag baint úsáide as IP Wash Buffer 1 .
10. Déan céimeanna 7 agus 8 uair amháin ag baint úsáide as IP Wash Buffer 2 .
IV. Léiriú IP
Cuir 150 μL 1X maolán elution IP leis na coirníní nite, caipín go docht, agus gor ag 65 céim le croitheadh bríomhar ar feadh 30 nóiméad. Mura bhfuil teirmiméadar ar fáil, cuir an colún i mbloc teasa ag 65 céim agus gor ar feadh 40 nóiméad. Casadh an feadán gach 10 nóiméad chun na coirníní a athbhunú.
Le linn na céime elution, ullmhaigh feadán microcentrifuge 1.5 mL ina bhfuil 6 μL 5M NaCl agus 2 μL 20mg/mL proteinase K do gach IP.
Leáigh 10% den ionchur agus cuir 150 μL 1X maolán elution IP, 6 μL 5M NaCl, agus 2 μL 20mg/mL proteinase K. Cuir an feadán ag teocht an tseomra go dtí an chéad chéim eile.
Tar éis goir ag 65 céim, bain an feadán as an mbloc teasa agus bailigh na coirníní ag baint úsáide as seastán maighnéadach.
Bain an comhshnáthán (ina bhfuil na coimpléisc próitéine-crómatin eluted) agus cuir NaCl agus proteinase K leis an bhfeadán ullmhaithe. Cuir caipín ar an bhfeadán lártheifneoir 1.5 mL, vortex gach sampla IP agus ionchuir, agus cuir i mbloc teasa 65 céim ar feadh 1.5 h.
V. Íonú DNA
Cuir 750 μL de Mhaolán Ceangailteach DNA le gach IP eluted agus sampla ionchuir.
Cuir 500 μL de gach sampla le colún íonú DNA agus cuir isteach i bhfeadán bailiúcháin 2 mL. Lártheifneoir an colún ag 10,000 × g ar feadh 1 nóiméad agus caith an leacht.
Cuir an sampla atá fágtha leis an gcolún céanna um íonú DNA. Lártheifneoir an colún ag 10,000 × g ar feadh 1 nóiméad agus caith an leacht.
Cuir an colún ar ais isteach sa fheadán bailiúcháin agus cuir 750 μL de mhaolán níocháin colún DNA leis. Lártheifneoir an colún ag 10,000 × g ar feadh 1 nóiméad agus caith an leacht.
Cuir an colún ar ais isteach sa fheadán bailiúcháin folamh agus sa lártheifneoir ag 10,000 × g ar feadh 2 nóiméad.
Cuir an colún i bhfeadán lártheifneoir nua 1.5 mL agus cuir 50 μL de thuaslagán colún DNA díreach go lár gach colúin.
Lártheifneoir ag 10,000 × g ar feadh 1 nóiméad agus caith an colún amach. Is é an réiteach mar thoradh air an DNA íonaithe. Lean ar aghaidh chuig seq nó braite qPCR.